酶聯(lián)免疫吸附劑測(cè)定法，簡(jiǎn)稱酶聯(lián)免疫法，或者ELISA法。具體的操作步驟大致分為加樣本、溫育、洗板、加酶標(biāo)物、溫育、洗板、加顯色劑、溫育、加終止液、比色讀數(shù)。當(dāng)然具體的檢驗(yàn)步驟還是嚴(yán)格按照試劑說(shuō)明書(shū)來(lái)操作。每一個(gè)小步驟出了問(wèn)題都可能影響整個(gè)實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性。所以我們應(yīng)該注意每一個(gè)細(xì)節(jié)。細(xì)節(jié)決定成敗。下面咱們就來(lái)細(xì)說(shuō)一下ELISA實(shí)驗(yàn)中需要注意的問(wèn)題。
一、標(biāo)本
1、避免溶血；
2、盡量新鮮，避免細(xì)菌污染（一般5天內(nèi)測(cè)量的血清可在4℃條件下保存，否則低溫保存）。
二、試劑
1、使用前平衡至室溫；
2、配置洗板液應(yīng)該使用去離子水或者蒸餾水，保證水的新鮮。
三、設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)
1、設(shè)計(jì)好孔位，通常陰陽(yáng)對(duì)照2個(gè)孔，空白對(duì)照1孔（必要時(shí)做好標(biāo)注，避免錯(cuò)誤）。
四、加樣
1、樣品應(yīng)全部加于反應(yīng)孔底部，避免液體懸掛在孔壁上，并注意不可濺出，不可產(chǎn)生氣泡；
2、加樣量準(zhǔn)確；
3、手工操作時(shí)加一下樣本時(shí)要及時(shí)更換吸嘴。
五、溫育
1、溫度、時(shí)間要嚴(yán)格控制；
2、最好使反應(yīng)杯盡快升高到所需溫度；
3、溫育常采用的溫度有43℃、37℃、室溫等。37℃是實(shí)驗(yàn)室中常用的保溫溫度，也是大多數(shù)抗原抗體結(jié)合的合適溫度。
六、洗板
1、使用專用洗滌液，一般洗滌4-6次；
2、若手工洗滌，前兩次洗滌都不溢出反應(yīng)孔，防止污染，后面幾次洗滌都應(yīng)加滿反應(yīng)孔，這樣洗滌更干凈；
3、每次加洗滌液后應(yīng)浸泡30秒，再甩去洗液；
4、反應(yīng)板倒扣吸水紙上拍干。
七、顯色與比色
1、空白孔校零，讀取各孔OD值；
2、單波長(zhǎng)or雙波長(zhǎng)選擇：
a、單波長(zhǎng)通常對(duì)顯色具有最大吸收的450nm或492nm；
b、雙波長(zhǎng)則是在敏感波長(zhǎng)450nm和非敏感波長(zhǎng)630nm下各測(cè)一次。使用雙波長(zhǎng)時(shí)不用設(shè)置空白孔，否則會(huì)造成孔吸光度為負(fù)數(shù)。
了解并有效地避開(kāi)以上提到的實(shí)驗(yàn)雷區(qū)，可以大大提高實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性，相信只要用心思考你就會(huì)成為最專業(yè)的檢驗(yàn)師，山東博科酶免為您提供最周到細(xì)致的服務(wù)，為了人類的美好明天，我們一直在努力！
